Diferenciace leukemických buněk HL-60 indukovaná společným působením cytokinů a inhibitorů metabolismu kyseliny karachidonové výrazně moduluje expresi 5-lipoxygenázy a proteinů IκB a Bcl-2

Mezi významné regulátory cytokinetiky hematopoietických buněk abpatří kromě cytokinů TNF-α a TGF-ß1 také kyselina arachidonová (AA) a její metabolity, jejichž produkce může být modulována inhibitory jako jsou MK-886, proadifen, indomethacin a kyselina nordihydroguaretová (NDGA) (Rizzo 2002, Secchiero et al. 2003, Ruscetti a Bartelmez 2001). Studium signálních drah těchto regulátorů směřuje k nalezení novým cíleným protinádorovým terapiím, které by mohly vést k snížení proliferace či naopak indukci smrti nádorových buněk. K buněčné smrti často dochází následkem terminální diferenciace původně nezralých nádorových buněk a právě to bylo předmětem studia této práce. Jedním ze styčných bodů zmíněných regulačních drah je transkripční kaktivátor NF-_kB (Aggarwal 2004, Panwalkar et al. 2004, Lu et al. k2004). Důležitost NF-_kB je akcentována tím, že zvýšení úrovně jeho aktivity vede k rezistenci nádorových buněk k apoptóze aindukované pomocí TNF-α (Jeremias et al. 1998). Dalším proteinem, jehož zvýšený výskyt je doprovázen sníženou úrovní apoptózy je kBcl-2. Transaktivace exprese genu bcl-2 proteinem NF-_kB posiluje pravděpodobnost přežití buňky (Tamatani et al. 1999). Signální dráha cytokinu TNF-α zahrnuje aktivaci metabolismu AA, která může být dále modifikována účinkem inhibitorů 5-lipooxygenázy (5-LPO) MK886, cykloxygenázy I, II (COX I, II) proadifenu a indomethacinu, a dále NDGA, látky inhibující především dráhu 5-LPO, a částečně dráhy metabolizmu AA katalyzované COX a za účasti cytochromu P450 (Wu et al. 1998, Brash 2001). Cílem této studie bylo sledovat vliv inhibitorů AA metabolismu, kteří mohou anasmě rovat dráhu TNF-α vedoucí původně k apoptóze k terminální diferenciaci.
Buněčným modelem této studie byla myeloidní linie HL-60 derivovaná z buněk akutní promyelocytární leukémie, která byla kultivována v RPMI médiu se sníženým obsahem séra. Buňky byly předem ovlivněny inhibitory metabolismu AA (5 µM MK886,50 µM indomethacin, 10 µM proadifen a 5 µM NDGA) a po jedné hodině byly abk této suspenzi přidány cytokiny (1 ng/ml TNF-α, 100 pM TGF-ß1), a to jednotlivě nebo v kombinaci. Úroveň exprese studovaných proteinů byla stanovena denzitometrickou kvantifikací Western blotů. Výskyt povrchových diferenciačních markerů CD11b a CD14 a hladina reaktivních kyslíkových radikálů (ROS) byly stanoveny pomocí průtokové cytometrie. Přítomnost buněk zaniklých apoptotickou formou buněčné smrti byla hodnocena morfologicky (barvení DAPI) nebo pomocí detekce štěpení kaspázových substrátů Western blottingem.
Nezralé leukemické buňky linie HL-60 ovlivněné společným apůsobením TNF-α a MK-886 nebo proadifenu po pěti dnech inkubace exprimovaly povrchové markery diferenciace, kdežto účinek indomethacinu a NDGA byl významně nižší. Tato diferenciace byla doprovázena a následována zvýšením výskytu apoptotických buněk. Nejvíce apoptotických buněk bylo prokázáno ve vzorcích ovlivněných působením jednoho z inhibitorů a oběma cytokiny a tyto buňky většinou vykazují znaky diferenciace. U buněk, ke kterým byly kromě jednoho z inhibitorů přidány oba cytokiny, docházelo k zástavě buněčného cyklu v G0/G1 fázi, což negativně korelovalo s počtem buněk v S fázi. Fáze G0/G1 je tedy bodem, kde buňky opouštějí cyklus a podléhají buněčné smrti. Vzorky obsahující TGF-ß1 v jakékoli kombinaci měly zvýšenou expresi 5-LPO už po třech dnech, a to i v případě, že byly ko-kultivovány s jejím inhibitorem. Všechny kombinace zásahů azahrnující TNF-α – tj. více či méně diferencované buňky – obsahovaly jen minimální množství nedegradovaného I_kB a to po celou sledovanou periodu pěti dnů, což je znakem aktivace NF-_kB . Ačkoli je NF-_kB přímým aktivátorem exprese Bcl-2, ve vzorcích obsahujících aktivovaný NF-_kB byla pozorována snížená exprese Bcl-2 po třech dnech kultivace. To naznačuje, že účinek NF-_kB podporující přežití buňky byl překonán buněčnou smrtí doprovázející terminální diferenciaci.

Tento projekt byl podporován grantem č. 524/03/0766 agentury GAČR a IGA AVČR číslo 1QS50004050705

Literatura

1. Aggarwal BB (2004): NF_kB: The enemy within. Cancer cell, 6: 203-8
2. Brash AR (2001): Arachidonic acid as a bioactive molecule. J Clin Invest, 107 (11): 1339-45
3. Panwalkar A., Vestovsek S, Giles F (2004): NF_kBmodulation as a therapeutic approach in hematologic malignancies. Cancer 100 (8): 1578-89
4. Rizzo MT (2002): The role of arachidonic acid in the normal and malignant hematopoiesis. Prostaglandins, Leukotriens and
   Essential Fatty Acids, 66 (1): 57-69
5. Ruscetti FW, Bartelmez SH (2001): TGF beta, pleiotropic regulator of hematopoietic stem cells: potential physiological and clinical relevance. Int J Hematol 74 (1): 18-25
6. Secchiero P, Milani D, Gonelli A et al. (2003): TNF-related kapoptosis-inducing ligand (TRAIL) and TNF – a promote the
   NFB_k dependent maturation of normal and leukemic myeloid cells. J. Leukoc Biol, 74: 223-32
7. Tamatani M, Che YH, Matsuzaki H, et al. (1999): Tumor necrosis factor induces Bcl-2 and Bcl-x expression through NFkappaB activation in primary hippocampal neurons. J Biol Chem, 274 (13): 8531-38
8. Wu YL, Jiang XR, Newland AC et al. (1998): Failure to activate cytosolic phospholipase A2 causes TNF resistance in Human
   Leukemic cells. J Immunol 160: 5929-35