Sérové hladiny angiogenních factorů u nemocných s renálním karcinomem a jejich prognostický význam

Úvod

Přítomnost zánětlivé reakce různé intenzity a charakteru je častým nálezem v nádorové tkáni. Vlivem mikroprostředí nádorového stroma mohou buňky přirozené i získané imunity ztrácet svoji původní protinádorovou funkci. Naopak produkcí řady biologicky aktivních látek (cytokinu, chemokinů, růstových faktorů) mohou podporovat růst a šíření nádoru.

Cíl práce

V průběhu naší práce jsme posuzovali sérové koncentrace deseti vybraných cytokinu a chemokinů v převážné většině s angiogenním potenciálem u nemocných s nově diagnostikovaným renálním adenokarcinomem. Sledovanými cytokiny byly: angiogenin, MCP-1 (CCL2), GRO alfa (CXCL1), interleukin-8 (CXCL8), ENA-78 (CXCL5), endoglin (CD105), interleukin-6, TGF-|31, VEGF a bFGF. Sérové hladiny sledovaných cytokinu byly stanoveny opakovaně v přesně daných časových intervalech. První odběr byl uskutečněn před započetím terapie (v den operace před jejím zahájením), druhý odběr s odstupem 7 dnů a třetí s odstupem 3 měsíců od operace. Získaná data byla korelována s klinickými a histopatologickými nálezy. Současně byla shromážděna a hodnocena některá klinická data (věk, pohlaví, histopatologický grading tumoru, progrese onemocnění, smrt v průběhu sledování, přítomnost nádorové duplicity).

Soubor pacientů

Soubor pacientů byl tvořen 54 osobami, které byly hospitalizovány v období od února 2005 do února 2007 na Urologické klinice FN Hradec Králové k chirurgickému řešení nově diagnostikovaného adenokarcinomu ledviny (C64). Průměrný věk pacientů činil 64 let (muži 63.1 let, ženy 65.8 let), mužů v souboru bylo 34 (63%), žen 20 (37%). Dle histopatologického vyšetření byl adenokarcinom ledviny zastoupen ve 49 případech světlobuněčným (konvenčním) typem, ve 3 případech papilárním typem, po jednom případu chromofóbním a sarkomatoidním typem. Dle TNM klasifikace bylo stanoveno klinické stádium onemocnění. Do stádia I bylo zařazeno 23 pacientů, do stádia II 2 pacienti, do stádia III 16 pacientů a do stádia IV 13 pacientů. Na základě klinického stádia byli pacienti rozděleni do 3 hodnocených skupin: v první skupině pacienti se stádiem I a II, ve 2. skupině pacienti stádia III a ve 3. skupině pacienti stádia IV.

Metoda

Ke stanovení sérových koncentrací vyšetřovaných proteinů a jejich hodnocení v čase byli pacienti podrobeni opakovaným odběrům venózní krve z periferní žíly v přesně stanovených časových intervalech. První odběr byl proveden v den operace před jejím zahájením, druhý odběr s odstupem 1 týdne a třetí odběr s odstupem 3 měsíců. Odebrané vzorky krve byly po 1 hodině zcentrifugovány při 3000 rpm po dobu 10 minut, séra zmražena při -20°C a takto uchována až do doby jejich zpracování. Stejným způsobem byly zpracovány a uchovány kontrolní vzorky 15 dárců krve. Před vlastním zpracováním byly vzorky rozmraženy při pokojové teplotě. Stanovení koncentrací vybraných sérových proteinů bylo provedeno metodou ELISA s využitím reagencií firmy R&DSystems. Výsledné hodnoty byly odečteny na spektrofotometru při vlnové délce doporučené výrobcem.

Ke statistickému zhodnocení výsledků byl použit statistický software Statistica 7. Aplikovány byly následující metody: nepárový t-test, Fisherův exaktní test, Mann-Whitneyův test, Kolmogorov-Smirnovův test, Friedmanova ANOVA, Wilcoxonův párový test, Kruskal-Wallisova ANOVA, při vícenásobném porovnání byla výsledná p hodnota upravena Bonferroniho korekcí.

Výsledky a diskuze

Vliv přítomnosti tumoru na hladinu sledovaných cytokinu jsme hodnotili v 1. odběru před zahájení léčby. Naměřené sérové koncentrace cytokinu byly srovnány s hodnotami získanými od skupiny zdravých dárců krve. Hodnocení bylo provedeno zvlášť pro jednotlivé skupiny pacientů. Statisticky významné rozdíly oproti kontrolní skupině zdravých dárců jsme nalezli u následujících cytokinu: zvýšení sérových koncentrací bylo patrno u angiogeninu (v 1. skupině), u ENA-78 (v 1. skupině), u IL-6 (v 1., 2. i 3. skupině), u VEGF (ve 3. skupině), naopak snížení sérových koncentrací jsme pozorovali u IL-8 (v 1., 2. i 3. skupině), endoglinu (v 1., 2. a hraničně i ve 3. skupině) a hraničně u TGF-pl (ve 2. a 3. skupině).

Pooperační vývoj hladin cytokinu byl sledován v následujících 2 odběrech, provedených s odstupy 1 týdne a 3 měsíců od operace. Statisticky významné rozdíly jsme zaznamenali pouze u 3 hodnocených cytokinu. U GRO a, IL-6 a bFGF došlo k statisticky významnému vzestupu hladiny v odběru 2 ve srovnání s odběrem 1. Vedle těchto statisticky významných rozdílů byly však
patrné určité vývojové tendence prakticky u všech ostatních cytokinů (angiogeninu, MCP-1, ENA-78, endoglinu, TGF-betal, VEGF) a to nejenom u 1. skupiny pacientů, ale většinou i u 2. a 3. skupiny.

Meziskupinovým srovnáním sérových hladin cytokinů jsme chtěli odhalit souvislost mezi rozsahem primárního tumoru a hladinou těchto cytokinů. Statisticky významné rozdíly jsme zaznamenali převážně mezi 1. a 3. skupinou pacientů. Statisticky významně zvýšeny byly: IL-6, IL-8, VEGF, bFGF u 3. skupiny v odběru 1, dále IL-8 u 3. skupiny v odběru 2, vše ve srovnání s 1. skupinou. Statisticky významný rozdíl mezi skupinou 2 a 3 jsme zaznamenali u VEGF, kde hodnota 1. odběru byla u 3. skupiny statisticky významně vyšší než u 2. skupiny. Dle našeho pozorování by pokročilejší stádia renálního adenokarcinomu mohla být spojena s vyššími hladinami MCP-1, GRO a, VEGF, IL-6, IL-8, bFGF.

Klinická data byla zhodnocena jednak ve vztahu ke klinickému stádiu onemocnění a vybrané klinické parametry (progrese onemocnění, smrt pacienta v průběhu sledování, histopatologický grading tumoru) také ve vztahu k vybraným laboratorním datům. Statisticky významné meziskupinové rozdíly jsme neprokázali u věku, pohlaví a výskytu nádorové duplicity, naopak statisticky významné rozdíly jsme dle očekávání nalezli u progrese a smrti mezi 1. a 3. skupinou a mezi 2. a 3. skupinou pacientů. 1. a 3. skupina pacientů se statisticky významně lišily také v zastoupení jednotlivých stupňů histopatologického gradingu.

K porovnání klinických dat s daty laboratorními byly vybrány pouze ty parametry, u kterých jsme dříve zjistili statisticky významné meziskupinové rozdíly. Z klinických dat se jednalo o progresi onemocnění, smrt pacienta a histopatologický grading, z laboratorních parametrů byly meziskupinové rozdíly přítomny u MCP-1, GRO a, IL-8, ENA-78, IL-6, VEGF a bFGF. Pacienti, u kterých došlo v průběhu sledování k progresi onemocnění, měli předoperačně vyšší hladiny GRO a, IL-8, IL-6, VEGF a bFGF. Pacienti, kteří v průběhu sledování zemřeli, měli předoperačně vyšší hladiny GRO a, IL-6 a VEGF. Se 4. stupněm HPG byly spojeny vyšší hladiny GRO a (ve srovnání s l.,2. i 3. stupněm) a IL-6 (ve srovnání se stupni 1 a 2. Stupeň 3. HPG byl spojen s nižší sérovou hladinou ENA-78 (ve srovnání s 2. stupněm).

Závěr

Zjištěné statisticky významné rozdíly v sérových koncentracích některých cytokinů je třeba interpretovat s velkou obezřetností. Poměrně nízký počet hodnocených vzorků a tím i volba slabších neparametrických testů ke statistickému zpracování nám neumožňuje zobecňovat dosažené výsledky. K jejich potvrzení by bylo třeba rozšířit vyšetřovaný soubor pacientů.

Použitá literatura

1. Coussens LM, Werb Z. Inflammation and cancer. Nature 2002; 420: 860-867.
   
2. Banchereau J, Steinman RM. Dendritic cells and the control of immunity. Nature 1998; 392: 245-52.
   
3. Sozzani S, Allavena P, Vecchi A et al. Chemokines and dendritic cell traffic. J Clin Immunol 2000; 20: 151-160.
   
4. Zijlstra A, Seandel M, Kupriyanova TA et al. Proangiogenic role of neutrophil-like inflammatory heterophils during neovascularization induced by growth factors and human tumor cells. Blood 2006; 107: 317-327.
   
5. Distler JW, Hirth A, Kurowska-Stolarska M et al. Angiogenic end angiostatic factors in the molecular control of angiogene-sis. QJ Nucl Med 2003; 47: 149-161.
   
6. Soloski MJ. Recognition of tumor cells by the innate immune systém. Curr Opin Immunol 2001; 13: 154-162.
   
7. Bukowski RM, Rayman P, Molto L et al. Interferon-y and CXC Chemokine Induction By Interleukin 12 in Renal Cell Carci-noma. Clin Cancer Res 1999; 5: 2780-2789.
   
8. Lukešová Š, Kopecký O. Protinádorová imunitní odpověď. Alergie 2007; 3: 241-244.
   
9. 0'Byrne KJ, Dalgleish AG. Chronic immune activation and inflammation as the cause of malignancy. Brit J Cancer 2001; 85(4): 473-483.
   
10. O'Byrne KJ, Dalgleish AG, Browning MJ et al. The relationship between angiogenesis and the immune response in carcinogenesis and the progression of malignant disease. Eur J Cancer 2000; 36: 151-169.
    
11. Raman D, Baugher PJ, Thu YM et al. Role of chemokines in tumor growth. Cancer Letters 2007; 256: 137-165.

Tato práce vznikla s podporou grantového projektu IGA MZ ČR číslo NR/8914-4