SROVNÁNÍ NEJČASTĚJI VYUŽÍVANÝCH METOD DETEKCE HOT SPOT MUTACE GENU NOTCH1 U PACIENTŮ S CHRONICKOU LYMFOCYTÁRNÍ LEUKEMIÍ

Konference: 2016 XL. Brněnské onkologické dny a XXX. Konference pro nelékařské zdravotnické pracovníky

Kategorie: Maligní lymfomy a leukémie

Téma: XXVII. Hematoonkologie

Číslo abstraktu: XXVII/186

Autoři: Eva Vávrová; Mgr. Barbara Kantorová; Barbara Vonková; RNDr. Jitka Kabáthová; Mgr. Jana Kotašková; RNDr. Jitka Malčíková, Ph.D.; Mgr. Karla Plevová (roz. Malinová), Ph.D.; prof. MUDr. Michael Doubek, Ph.D.; prof. MUDr. Jiří Mayer, CSc.; prof. RNDr. Šárka Pospíšilová, Ph.D.

Východiska:

Chronická lymfocytární leukemie (CLL) patří v ČR mezi nejčastěji diagnostikovanou leukemii dospělé populace. Toto onemocnění je charakterizované mimořádně heterogenním a těžko předvídatelným klinickým průběhem. Mezi významné nepříznivé markery CLL mající vliv na léčebnou rezistenci a zkrácené přežívání pacientů patří mutace transmembránového receptoru NOTCH1. Optimální metodika pro rutinní analýzu nejčastěji se vyskytující hot spot mutace genu NOTCH1 (c.7541_7542delCT, 80 % NOTCH1 mutací) však nebyla dosud stanovena. Cílem této studie tedy bylo porovnat účinnost tří běžně využívaných molekulárně-biologických metod při detekci hot spot NOTCH1 mutace u pacientů s CLL.

Materiály a metody:

Mutace c.7541_7542delCT genu NOTCH1 byla vyšetřena na souboru 91 neléčených pacientů s CLL sledovaných na Interní hematologické a onkologické klinice FN Brno. Výchozím materiálem pro analýzu byla DNA izolovaná ze separovaných CD19+ lymfocytů popřípadě mononukleárních buněk periferní krve. Pro mutační detekci byly u všech vzorků paralelně použity následující metody: přímé Sangerovo sekvenování, fragmentační analýza a alelově specifická PCR (AS PCR). V případě Sangerova sekvenování a fragmentační analýzy byl výskyt hot spot NOTCH1 mutace hodnocen na ABI PRISM 3700 Genetic Analyzer. Při AS PCR byly výsledné amplifikační produkty analyzovány s využitím QIAxcel DNA screening kitu (Qiagen).

Výsledky:

Pomocí kombinace všech zvolených metodik byla mutace c.7541_7542delCT genu NOTCH1 detekována celkem u 13 % (12/91) pacientů s CLL. Přímé Sangerovo sekvenování a fragmentační analýza byly schopny určit všech 12 vzorků nesoucích hot spot mutaci genu NOTCH1. V případě AS PCR nebyla přítomnost této mutace u jednoho pacienta rozpoznána z důvodu jejího nízkého procentuálního zastoupení. Oproti ostatním přístupům je však AS PCR méně laboratorně náročná. Na rozdíl od AS PCR a fragmentační analýzy umožnilo Sangerovo sekvenování také detekci dalších sekvenčních variant nacházejících se v analyzované genové oblasti.

Závěr:

Všechny použité metodiky spolehlivě detekovaly přítomnost hot spot mutace c.7541_7542delCT genu NOTCH1. Při vyšetření této konkrétní mutace lze tedy v rutinní praxi laboratorně náročnější Sangerovo sekvenování nahradit fragmentační analýzou, popřípadě alelově specifickou PCR.

Studie byla podpořena granty AZV-MZ-CR 15-31834A, MSMT CEITEC2020 (LQ1601) a MZ ČR - RVO (FNBr, 65269705).

Datum přednesení příspěvku: 28. 4. 2016