Účinek ellipticinu na neuroblastom a jeho ovlivnění kyselinou valproovou – studie in vitro

Úvod
Ellipticin (5,11-dimethyl-6H-pyridol4,3-bcarbazol) je alkaloid izolovaný z rostlin čeledi Apocyanaceae (1959). Některé jeho solubilní deriváty mají protinádorové a anti-HIV účinky. V klinické praxi se používají deriváty ellipticinu v léčbě pokročilého karcinomu prsu s kostními metastázami a myeloblastické leukémie. Molekulu ellipticinu lze modifikovat a byla připravena řada derivátů s protinádrovými účinky. Některé deriváty (substituce na N²) inhibují P-glykoprotein jiné jsou jeho substrátem. Hlavními mechanismy protinádorového účinku ellipticinu jsou interkalace do DNA, inhibice topoizomerázy II a nedávno popsaná kovalentní modifikace DNA s tvorbou aduktů. Pro účinnost ellipticinu a tvorbu aduktů je nezbytná jeho oxidace v cílové tkáni za vzniku aktivních forem. Enzymy oxidující ellipticin jsou cytochromy P450 (CYP) a peroxidázy. Nejúčinnější metabolity ellipticinu, 13-hydroxyellipticin a N2-oxid ellipticinu, které se kovalentně váží na DNA za tvorby aduktu deoxyguanosin-ellipticin, vznikají zejména oxidací cytochromy CYP1A1a CYP3A4. V tumorech citlivých na ellipticin (např. karcinom prsu) byla prokázaná vyšší exprese cytochromů v nádorové tkáni než peritumorálně. Rozdílnou distribucí oxidačních enzymů lze vysvětlit relativně selektivní působení ellipticinu. Ellipticin a jeho deriváty mají vysokou účinnost proti některým typům nádorových onemocnění, méně závažné nežádoucí účinky (ellipticin není hematotoxický) a selektivní účínek.
Ve studii jsme řešili: 1) porovnání účinnosti ellipticinu a doxorubicinu u chemosenzitivních a chemorezistentních buněčných liniích neuroblastomů (NBL); 2) posouzení účinku ellipticinu na buněčných liniích NBL exprimujících P-glykoprotein oproti buněčným liniím NBL s jiným mechanismem rezistence; 3) stanovení majoritních DNA-aduktů v buněčných liniích NBL a jejich korelaci s cytotoxickým účinkem; 4) působení ellipticinu na buněčný cyklus a indukce apoptózy v buněčných liniích NBL; 5) vliv inhibitorů histondeacetylázy trichostatinu A a kyseliny valproové na cytotoxický účinek ellipticinu.

Materiál a metody
Buněčné linie odvozené od NBL vysokého rizika (amplifikace N-myc, del 1p36, +17q) izolované od pacientů dětské kliniky ve Frankfurtu n M. UKF-NB-3 a UKF-NB-4 a od nich odvozené linie, u kterých byla navozena rezistence na vybraná cytostatika (DOXO, VCR, CDDP) a linie IMR-32 a od ní odvozená linie rezistentní k doxorubicinu. Rezistence jsme indukovali dlouhodobou kultivací v mediu se vzrůstající koncentrací příslušného cytostatika. Linie UKF-NB-4, UKF-NB-3(^DOXO), UKF-NB-3(^VCR), UKF-NB-4(^DOXO) a UKF-NB-4(^VCR) exprimovaly P-glykoprotein, ostatní použité linie jej neexprimovaly. U linie IMR-32(^DOXO) u které jsme neprokázali ani P-glykoprotein ani schopnost vypuzovat Rh123 z buněk, byla rezistence k doxorubicinu zajištěna jiným mechanizmem než expresí P-glykoproteinu.
Pro určení cytotoxicity ellipticinu a doxorubicinu a pro posouzení vlivu inhibitorů histondeacetylasy jsme použili MTT test. Adukty deoxyguanosnin-ellipticin jsme stanovili metodou 32P postlabelingu. Parametry buněčného cyklu, apoptózu a expresi P-glykoproteinu jsme vyšetřili průtokovým cytometrem.

Výsledky
MTT testem jsme prokázali vysokou citlivost buněčných linií NBL na ellipticin. IC50 pro ellipticin byla u všech buněčných linií nižší než 1µM. V porovnání s doxorubicinem je ellipticin účinnější u buněčných linií exprimujících P-glykoprotein (linií rezistentních na doxo a VCR) (UKF-NB-3(^DOXO) UKF-NB-3(^VCR), UKF-NB-4(^DOXO), UKF-NB-4(^VCR)). Doxorubicin byl účinnější u mateřských buněčných linií (IMR-32, UKF-NB-3 a UKF-NB-4) a u chemorezistentních linií neexprimující P-glykoprotein (IMR-32(^DOXO), UKF-NB-3(cddp) a UKF-NB-4(^CDDP)).
Majoritní adukty byly tvořeny 13- hydroxyellipticinem a N2-oxid ellipticinem a jejich tvorba korelovala s účinkem ellipticinu. Významnější změny buněčného cyklu (pokles podílu buněk v G0/G1 fázi) jsme nalezli pouze u dceřiné linie UKF-NB-4 a UKF-NB-4(^CDDP), ale ne u UKF-NB-4(^DOXO) a to až u vyšších koncentraci ellipticinu (10µM).
Prokázali jsme potenciaci protinádorového účinku ellipticinu na neuroblastomové buňky inhibitory histondeacetylázy – kyselinou valproovou a trichostatinem A.

Diskuse
Ellipticin je cytostatikum, které je v současné době v klinické praxi používáno pouze omezeně. Hlavní indikací je metastazující karcinom prsu, kde jeho účinnost může souviset s přítomností laktoperoxidázy a CYP1A1a CYP3A4 v nádorových buňkách. Přítomnost CYP může být indukována hypoxií nádorové tkáně. Podobně tomu je i v případě akutní myeloidní leukémie, kde je aktivace ellipticinu zajištěna myeloperoxidázou, kterou blasty této leukémie exprimují.
V naší in vitro studii jsme prokázali účinnost ellipticinu na buněčné linie odvozené od neuroblastomu nejvyššího rizika. Na rozdíl od předchozí studie prováděné na buněčné linii odvozené od karcinomu prsu jsme nenalezli zkříženou rezistenci s antracykliny (1).
Potenciace protinádorového účinku ellipticinu inhibitory histondeacetylázy valproátem a trichostatinem A se jeví perspektvní. Předpokládaným mechanizmem účinku je rozvolnění vazby mezi histony a DNA, která se tak stává přístupnější účinku cytostatika (2). Ellipticin, vzhledem k absenci hematologické toxicity, nepřítomnosti zkřížené rezistence s antracykliny a účinnosti na linie s expresí P-glykproteinu, se zdá nadějná zvláště v léčbě chemorezistentních nádorů s expresí P-glykoproteinu.

Literatura:

1. Ivy SP, Tulpule A, Fairchild CR, Averbuch SD, Myers CE, Nebert DW, Baird WM. Cowan KH.J Biol Chem 1988;263:19119-25.
2. Kim MS, Blake M, Baek JH, Kohlhagen G, Pommier Y, Carrier F. Cancer Res. 2003 Nov 1;63(21):7291-300.

Práce vznikla za finanční podpory výzkumných záměrů MŠMT č. MSM 0021620813 a Hilfe fü r krebskranke Kinder Frankfurt e.V