Konference: 2005 XXIX. Brněnské onkologické dny a XIX. Konference pro sestry a laboranty
Kategorie: Nádorová biologie/imunologie/genetika a buněčná terapie
Téma: Pokroky v molekulární biologii nádorů
Číslo abstraktu: 051
Autoři: prof. RNDr. Jiřina Hofmanová, CSc.; prof. RNDr. Alois Kozubík, CSc.
Úvod
V současné době je již literárně dostatečně dokumentováno, že kromě nutričního účinku mají lipidy také strukturální a regulační úlohu s významným dopadem na fyziologické funkce organizmu a představují tedy mnohem více, než pouhý zdroj energie. Spolu s cytokiny a hormony fungují jako intra- i intercelulární mediátory a modulátory buněčné signalizační sítě [1, 2]. Poměr obsahu ω-6 a ω-3 esenciálních vysoce nenasycených mastných kyselin (VNMK) modifikují vlastnosti membrán, zejména jejich fluiditu a produkci látek vznikajících hydrolýzou membránových fosfolipidů. Tyto změny pak ovlivňují vazbu cytokinů, aktivitu receptorů i funkci na membránu vázaných signálních molekul. Změny membránových fosfolipidů přímo ovlivňují syntézu lipidových mediátorů typu eikosanoidů [3, 4] a mohou modulovat i aktivitu transkripčních faktorů [5] a expresi genů [6]. To má důležitý dopad na řadu imunitních a buněčných funkcí včetně proliferace, diferenciace a apoptózy [7].
Lipidová parenterální výživa
Totální parenterální výživa (TPN) je velmi důležitou součástí léčby pacientů nacházejících se v kritickém stavu, včetně onkologických. Lipidy v ní obsažené slouží především jako zdroj energie a esenciálních MK, mohou však významně ovlivňovat i metabolické reakce a imunitu těchto pacientů [8].
Velká část komerčních tukových emulzí je vyráběna na základě sójového nebo saflorového oleje či jejich směsí, které obsahují triglyceridy s mastnými kyselinami s dlouhým řetězcem (LCT) a s převažujícím obsahem ω-6 VNMK, zejména kyseliny linolové (18:2, ω-6). LCT bývají někdy kombinovány s triglyceridy obsahujícími mastné kyseliny (MK) se středním řetězcem (MCT), a to obvykle z kokosového oleje. Tato kombinace se ukazuje výhodná zejména z hlediska rychlejšího vymizení MCT z plazmy, absence ukládání tuku do jater a následné steatózy a potřeby karnitinu. Jsou vyvíjeny nové typy emulzí obsahující tzv. strukturované lipidy nebo rybí olej (RO), případně směs LCT, MCT, olivového oleje a RO doplněné vitaminem E, označované zkratkou SMOF[9, 10].
Současné poznatky ukazují velké výhody nových lipidových emulzí obsahujících RO[3]. Ten je bohatý na ω-3 VNMK, zejména kyselinu eikosapentaenovou (EPA, 20:5) a dokosahexaenovou (DHA, 22:6). Experimentální i randomizované klinické studie prokázaly po parenterální aplikaci RO rychlou inkorporaci EPA a DHA do membrán různých buněčných typů a následné snížení poměru kyseliny arachidonové (AA, 20:4, ω-6) ku EPA [11, 12]. Bylo prokázáno, že přítomnost RO v dietě nebo dodání ω-3 VNMK má pozitivní imunomodulační a terapeutické účinky v experimentálních zvířecích modelech nebo u lidí s různými onemocněními [13].
<<b>Lipidové složky výživy a nádorová onemocnění
V poslední době vzrůstá zájem o využití vlastností ω-3 VNMK v řadě medicínských odvětvích včetně onkologie [14]. Byly prokázány antiproliferační a apoptické účinky VNMK na řadu nádorových buněčných linií in vitro [15] i protinádorové účinky RO, který je obsahuje ve vysokém množství, v experimentálních systémech in vivo. ω-3 VNMK jsou uvažovány jako chemopreventivní látky pro adjuvantní terapii některých typů nádorů [16]. Mohly by ovlivňovat proliferaci a apoptózu nádorových buněk a zvyšovat účinnost chemo- radio- a hypertermické terapie díky svým účinkům na buněčné membrány (zvýšená lipoperoxidace a modifikace nádorového stromatu) [17]. RO nebo čistá EPA byla podávána nádorovým pacientům a byly pozorovány pozitivní účinky nejen na funkce imunitního systému, ale také na rozvoj nádorové kachexie a v některých případech délku přežití [18].
Z experimentálních studií na zvířatech však jasně vyplývá, že také zdroj lipidů v TPN může ovlivnit nádorový i hostitelský proteinový metabolizmus a strukturované lipidy z MCT a RO mohou zlepšit proteinový metabolizmus i rovnováhu dusíku v tkáních hostitele bez stimulace růstu nádorů [19].
TPN obsahující pouze zdroj ω-6 VNMK stimuluje produkci eikosanoidů a specifických zejména zánětlivých cytokinů (např. TNF-α), které mohou působit imunosupresivně a podporovat proliferaci nádorových buněk a vznik metastáz. Přídavek RO může tyto procesy pozitivně ovlivnit. Změny složení VNMK v membránách by mohly také významně ovlivnit působení některých chemoterapeutik nebo záření [20-23].
Odlišný lipidový metabolizmus normálních a nádorových buněk vede k úvahám o selektivním působení VNMK. Nádorové buňky mají snížený obsah VNMK v membránách, sníženou aktivitu desaturáz a jsou tak relativně rezistentní k lipidové peroxidaci ve srovnání s buňkami normální tkáně. Byly prokázány cytotoxické účinky VNMK in vitro na nádorové buňky a absence těchto účinků u buněk normálních [24].
Na základě poznatků z experimentální oblasti in vitro a in vivo prokazujících různé účinky ω-6 a ω-3 VNMK na tkáňové, buněčné a subbuněčné úrovni je nutné uvažovat o lipidech jako o látkách, kterými lze příznivě (či nepříznivě) ovlivnit řadu patofyziologických procesů a modifikovat účinky léků.
Přes širokou škálu poznatků o účincích různých typů VNMK je však známo poměrně málo o účincích různých typů lipidových emulzí na specifické buněčné typy a o rozdílech v odpovědi nádorových a normálních buněčných populací.
Účinky lipidových emulzí na buněčné populace in vitro
Naše studie byly zaměřeny na srovnání působení různých typů komerčních lipidových emulzí našich i zahraničních výrobců na nádorové i nenádorové buňky in vitro.
Buněčné linie: buňky myeloidní leukémie HL-60 a epiteliální buňky odvozené z adenokarcinomu tlustého střeva (HT-29) nebo normálního fetálního střeva (FHC).
Lipidové emulze: emulze vyráběné v ČR (NutralipidP, NutralipidMCT, Deltalipid-obsahuje tokoferol) a v zahraničí (Intralipid, ClinOleic-obsahuje olivový olej, Omegaven-obsahuje RO) Původní 20% emulze byly ředěny na 0,2, 0,02 a 0,002% koncentrace (tj. 100x, 1000x a 10 000x). Výjimku tvořil 10% Omegaven, který byl ředěn na 0,002, 0,001 a 0,0005% koncentrace.
Studované parametry: akumulace triglyceridů v cytoplazmě (průtoková cytometrie-FCM, barvení NileRed); produkce reaktivních metabolitů kyslíku-RMK (FCM, barvení dihydrorodamin 123) a lipidová peroxidace (detekce TBARS spektrofotometrií); účinky antioxidant (Trolox – ve vodě rozpustný vitamín E) a cytokinetické parametry (počty buněk-Coulter Counter; buněčný cyklus - propidium jodid, FCM; buněčná smrt – viabilita po vitálním barvení eosinem; procento plovoucích buněk a subG0/G1 buněk - FCM jako ukazatel apoptózy).
A. Působení lipidových emulzí na myeloidní buňky
Souhrnně bylo prokázáno, že aplikace lipidových emulzí působí rychlé hromadění triglyceridů v cytoplazmě buněk, změny v oxidačním metabolizmu a cytokinetice. Obecně byly tyto účinky závislé na koncentraci použitých emulzí a době působení. 100 až 1000násobně ředěné emulze (v závislosti na typu) způsobily vysokou akumulaci triglyceridů v cytoplazmě buněk, zvyšovaly produkci RMK, inhibovaly růst a indukovaly buněčnou smrt. Oproti očekávání byly relativně intenzívní účinky na tyto parametry pozorovány u Deltalipidu, i přes zvýšený obsah antioxidantu tokoferolu v této emulzi. Výjimečně vysoké účinky byly detekovány u Omegavenu obsahujícího rybí olej.
Bylo prokázáno, že délka a způsob skladování lipidových emulzí jsou důležitým faktorem, protože emulze s prošlou expirací vyvolávaly v buňkách větší oxidativní stres a zvýšenou buněčnou smrt.
B. Srovnání působení lipidových emulzí na nádorové a nenádorové buňky kolonu
V pokusech srovnávajících odpověď nádorových (HT-29) a nenádorových (FHC) buněk kolonu byly použity LCT a LCT/MCT emulze různých výrobců 400 násobně zředěné. Analýzou spektra mastných kyselin metodou HPLC (dr. R. Hyšpler, FN UK Hr. Králové) bylo prokázáno, že po aplikaci všech typů emulzí dochází k významnému nárůstu obsahu kyseliny linolové v buněčných lipidech. Naproti tomu byl zaznamenán významný pokles obsahu kyseliny arachidonové, a omega-3 kyselin eikosapentaenové a dokosahexaenové ve srovnání s neovlivněnou kontrolou zejména u buněk nádorových.
Aplikace emulzí vyvolávala také oxidativní stres (zvýšenou peroxidaci lipidů a produkci RMK) a to ve větší míře u buněk nenádorových. Tyto účinky byly potlačeny přidáním antioxidantu Troloxu. Zatímco u buněk HT-29 nebyly významně ovlivněny cytokinetické parametry (počty buněk, buněčný cyklus, viabilita, počty plovoucích buněk a subG0/G1 populace), stejná koncentrace emulzí (s vyjímkou obou typů Nutralipidu) významně zvýšila počty plovoucích buněk a subG0/G1 populaci buněk FHC. Tento účinek byl významně redukován spolupůsobením Troloxu (Hofmanová).
Závěry
Na základě našich výsledků lze obecně shrnout, že lipidové emulze mohou v závislosti na koncentraci ovlivňovat cytokinetické parametry, a to pravděpodobně prostřednictvím změn v zastoupení mastných kyselin v membránách, lipidové peroxidace a produkce kyslíkových radikálů. To znamená, že parenterální aplikace tukových emulzí může mít nezanedbatelný vliv na základní fyziologické reakce a vlastnosti krevních buněk. Ukázalo se také, že běžné klinicky využívané lipidové emulze mohou odlišným způsobem ovlivňovat vlastnosti střevních buněk nádorového a nenádorového původu.
Souhrnně naše poznatky přispívají k lepšímu porozumění účinků lipidových emulzí na specifické buněčné typy a mohou pomoci jak při optimalizaci složení těchto emulzí tak k jejich cílenému využití v nutriční terapii určitých onemocnění včetně onkologických.
Literatura
Práce byla podporována granty GAČR 524/04/0895 a IGA AV ČR 1QS50004050705
V současné době je již literárně dostatečně dokumentováno, že kromě nutričního účinku mají lipidy také strukturální a regulační úlohu s významným dopadem na fyziologické funkce organizmu a představují tedy mnohem více, než pouhý zdroj energie. Spolu s cytokiny a hormony fungují jako intra- i intercelulární mediátory a modulátory buněčné signalizační sítě [1, 2]. Poměr obsahu ω-6 a ω-3 esenciálních vysoce nenasycených mastných kyselin (VNMK) modifikují vlastnosti membrán, zejména jejich fluiditu a produkci látek vznikajících hydrolýzou membránových fosfolipidů. Tyto změny pak ovlivňují vazbu cytokinů, aktivitu receptorů i funkci na membránu vázaných signálních molekul. Změny membránových fosfolipidů přímo ovlivňují syntézu lipidových mediátorů typu eikosanoidů [3, 4] a mohou modulovat i aktivitu transkripčních faktorů [5] a expresi genů [6]. To má důležitý dopad na řadu imunitních a buněčných funkcí včetně proliferace, diferenciace a apoptózy [7].
Lipidová parenterální výživa
Totální parenterální výživa (TPN) je velmi důležitou součástí léčby pacientů nacházejících se v kritickém stavu, včetně onkologických. Lipidy v ní obsažené slouží především jako zdroj energie a esenciálních MK, mohou však významně ovlivňovat i metabolické reakce a imunitu těchto pacientů [8].
Velká část komerčních tukových emulzí je vyráběna na základě sójového nebo saflorového oleje či jejich směsí, které obsahují triglyceridy s mastnými kyselinami s dlouhým řetězcem (LCT) a s převažujícím obsahem ω-6 VNMK, zejména kyseliny linolové (18:2, ω-6). LCT bývají někdy kombinovány s triglyceridy obsahujícími mastné kyseliny (MK) se středním řetězcem (MCT), a to obvykle z kokosového oleje. Tato kombinace se ukazuje výhodná zejména z hlediska rychlejšího vymizení MCT z plazmy, absence ukládání tuku do jater a následné steatózy a potřeby karnitinu. Jsou vyvíjeny nové typy emulzí obsahující tzv. strukturované lipidy nebo rybí olej (RO), případně směs LCT, MCT, olivového oleje a RO doplněné vitaminem E, označované zkratkou SMOF[9, 10].
Současné poznatky ukazují velké výhody nových lipidových emulzí obsahujících RO[3]. Ten je bohatý na ω-3 VNMK, zejména kyselinu eikosapentaenovou (EPA, 20:5) a dokosahexaenovou (DHA, 22:6). Experimentální i randomizované klinické studie prokázaly po parenterální aplikaci RO rychlou inkorporaci EPA a DHA do membrán různých buněčných typů a následné snížení poměru kyseliny arachidonové (AA, 20:4, ω-6) ku EPA [11, 12]. Bylo prokázáno, že přítomnost RO v dietě nebo dodání ω-3 VNMK má pozitivní imunomodulační a terapeutické účinky v experimentálních zvířecích modelech nebo u lidí s různými onemocněními [13].
<<b>Lipidové složky výživy a nádorová onemocnění
V poslední době vzrůstá zájem o využití vlastností ω-3 VNMK v řadě medicínských odvětvích včetně onkologie [14]. Byly prokázány antiproliferační a apoptické účinky VNMK na řadu nádorových buněčných linií in vitro [15] i protinádorové účinky RO, který je obsahuje ve vysokém množství, v experimentálních systémech in vivo. ω-3 VNMK jsou uvažovány jako chemopreventivní látky pro adjuvantní terapii některých typů nádorů [16]. Mohly by ovlivňovat proliferaci a apoptózu nádorových buněk a zvyšovat účinnost chemo- radio- a hypertermické terapie díky svým účinkům na buněčné membrány (zvýšená lipoperoxidace a modifikace nádorového stromatu) [17]. RO nebo čistá EPA byla podávána nádorovým pacientům a byly pozorovány pozitivní účinky nejen na funkce imunitního systému, ale také na rozvoj nádorové kachexie a v některých případech délku přežití [18].
Z experimentálních studií na zvířatech však jasně vyplývá, že také zdroj lipidů v TPN může ovlivnit nádorový i hostitelský proteinový metabolizmus a strukturované lipidy z MCT a RO mohou zlepšit proteinový metabolizmus i rovnováhu dusíku v tkáních hostitele bez stimulace růstu nádorů [19].
TPN obsahující pouze zdroj ω-6 VNMK stimuluje produkci eikosanoidů a specifických zejména zánětlivých cytokinů (např. TNF-α), které mohou působit imunosupresivně a podporovat proliferaci nádorových buněk a vznik metastáz. Přídavek RO může tyto procesy pozitivně ovlivnit. Změny složení VNMK v membránách by mohly také významně ovlivnit působení některých chemoterapeutik nebo záření [20-23].
Odlišný lipidový metabolizmus normálních a nádorových buněk vede k úvahám o selektivním působení VNMK. Nádorové buňky mají snížený obsah VNMK v membránách, sníženou aktivitu desaturáz a jsou tak relativně rezistentní k lipidové peroxidaci ve srovnání s buňkami normální tkáně. Byly prokázány cytotoxické účinky VNMK in vitro na nádorové buňky a absence těchto účinků u buněk normálních [24].
Na základě poznatků z experimentální oblasti in vitro a in vivo prokazujících různé účinky ω-6 a ω-3 VNMK na tkáňové, buněčné a subbuněčné úrovni je nutné uvažovat o lipidech jako o látkách, kterými lze příznivě (či nepříznivě) ovlivnit řadu patofyziologických procesů a modifikovat účinky léků.
Přes širokou škálu poznatků o účincích různých typů VNMK je však známo poměrně málo o účincích různých typů lipidových emulzí na specifické buněčné typy a o rozdílech v odpovědi nádorových a normálních buněčných populací.
Účinky lipidových emulzí na buněčné populace in vitro
Naše studie byly zaměřeny na srovnání působení různých typů komerčních lipidových emulzí našich i zahraničních výrobců na nádorové i nenádorové buňky in vitro.
Buněčné linie: buňky myeloidní leukémie HL-60 a epiteliální buňky odvozené z adenokarcinomu tlustého střeva (HT-29) nebo normálního fetálního střeva (FHC).
Lipidové emulze: emulze vyráběné v ČR (NutralipidP, NutralipidMCT, Deltalipid-obsahuje tokoferol) a v zahraničí (Intralipid, ClinOleic-obsahuje olivový olej, Omegaven-obsahuje RO) Původní 20% emulze byly ředěny na 0,2, 0,02 a 0,002% koncentrace (tj. 100x, 1000x a 10 000x). Výjimku tvořil 10% Omegaven, který byl ředěn na 0,002, 0,001 a 0,0005% koncentrace.
Studované parametry: akumulace triglyceridů v cytoplazmě (průtoková cytometrie-FCM, barvení NileRed); produkce reaktivních metabolitů kyslíku-RMK (FCM, barvení dihydrorodamin 123) a lipidová peroxidace (detekce TBARS spektrofotometrií); účinky antioxidant (Trolox – ve vodě rozpustný vitamín E) a cytokinetické parametry (počty buněk-Coulter Counter; buněčný cyklus - propidium jodid, FCM; buněčná smrt – viabilita po vitálním barvení eosinem; procento plovoucích buněk a subG0/G1 buněk - FCM jako ukazatel apoptózy).
A. Působení lipidových emulzí na myeloidní buňky
Souhrnně bylo prokázáno, že aplikace lipidových emulzí působí rychlé hromadění triglyceridů v cytoplazmě buněk, změny v oxidačním metabolizmu a cytokinetice. Obecně byly tyto účinky závislé na koncentraci použitých emulzí a době působení. 100 až 1000násobně ředěné emulze (v závislosti na typu) způsobily vysokou akumulaci triglyceridů v cytoplazmě buněk, zvyšovaly produkci RMK, inhibovaly růst a indukovaly buněčnou smrt. Oproti očekávání byly relativně intenzívní účinky na tyto parametry pozorovány u Deltalipidu, i přes zvýšený obsah antioxidantu tokoferolu v této emulzi. Výjimečně vysoké účinky byly detekovány u Omegavenu obsahujícího rybí olej.
Bylo prokázáno, že délka a způsob skladování lipidových emulzí jsou důležitým faktorem, protože emulze s prošlou expirací vyvolávaly v buňkách větší oxidativní stres a zvýšenou buněčnou smrt.
B. Srovnání působení lipidových emulzí na nádorové a nenádorové buňky kolonu
V pokusech srovnávajících odpověď nádorových (HT-29) a nenádorových (FHC) buněk kolonu byly použity LCT a LCT/MCT emulze různých výrobců 400 násobně zředěné. Analýzou spektra mastných kyselin metodou HPLC (dr. R. Hyšpler, FN UK Hr. Králové) bylo prokázáno, že po aplikaci všech typů emulzí dochází k významnému nárůstu obsahu kyseliny linolové v buněčných lipidech. Naproti tomu byl zaznamenán významný pokles obsahu kyseliny arachidonové, a omega-3 kyselin eikosapentaenové a dokosahexaenové ve srovnání s neovlivněnou kontrolou zejména u buněk nádorových.
Aplikace emulzí vyvolávala také oxidativní stres (zvýšenou peroxidaci lipidů a produkci RMK) a to ve větší míře u buněk nenádorových. Tyto účinky byly potlačeny přidáním antioxidantu Troloxu. Zatímco u buněk HT-29 nebyly významně ovlivněny cytokinetické parametry (počty buněk, buněčný cyklus, viabilita, počty plovoucích buněk a subG0/G1 populace), stejná koncentrace emulzí (s vyjímkou obou typů Nutralipidu) významně zvýšila počty plovoucích buněk a subG0/G1 populaci buněk FHC. Tento účinek byl významně redukován spolupůsobením Troloxu (Hofmanová).
Závěry
Na základě našich výsledků lze obecně shrnout, že lipidové emulze mohou v závislosti na koncentraci ovlivňovat cytokinetické parametry, a to pravděpodobně prostřednictvím změn v zastoupení mastných kyselin v membránách, lipidové peroxidace a produkce kyslíkových radikálů. To znamená, že parenterální aplikace tukových emulzí může mít nezanedbatelný vliv na základní fyziologické reakce a vlastnosti krevních buněk. Ukázalo se také, že běžné klinicky využívané lipidové emulze mohou odlišným způsobem ovlivňovat vlastnosti střevních buněk nádorového a nenádorového původu.
Souhrnně naše poznatky přispívají k lepšímu porozumění účinků lipidových emulzí na specifické buněčné typy a mohou pomoci jak při optimalizaci složení těchto emulzí tak k jejich cílenému využití v nutriční terapii určitých onemocnění včetně onkologických.
Literatura
- DiMarzo, V. (1995) Prostagl., Leuk. Ess. Fatty A. 53:
239-254.
- dePablo, M. A., M. A. Puertollano, et al. (2002) Clin.
Diagnost. Lab. Immunol. 9(5): 945 950.
- Fürst, P. and K. S. Kühn (2000) Clin Nutr 19(1):
7-14.
- Köller, M., M. Senkal, et al. (2003). Clin Nutr 22(1):
59-64.
- Maziere, C., M. A. Conte, et al. (1999). Biochem Biophys Res
Commun 265(1): 116-22.
- Jump, D. B. (2002 Current Opinion in Lipidology 13(2):
155-164.
- Rudolph, I. L., D. S. Kelley, et al. (2001). Nutrition Res.
21(1-2): 381-393.
- Adolph, M. (1999). Ann Nutr Metab 43(1): 1-13.
- Fürst, P. (1998). J. Nutr. 128(5): 789-796.
- Carpentier, Y. A. and I. E. Dupont (2000). World J Surg 24(12):
1493-7.
- Simoens, C., M. Richelle, et al. (1995). Clin. Nutr. 14(3):
177-185.
- Tashiro, T., H. Yamamori, et al. (1998 Nutrition 14(6):
551-3.
- Tapiero, H., G. N. Ba, et al. (2002). Biomedicine &
Pharmacotherapy 56(5): 215-222.
- Heyes, S. D., D. B. Gough, et al. (1996). Br J Surg 83(5):
608-19.
- Noding, R., S. A. Schonberg, et al. (1998). Lipids 33:
285-293.
- Rose, D. P. and J. M. Connolly (1999). Pharmacology &
Therapeutics 83(3): 217-244.
- Baronzio, F. F., L. Solbiati, et al. (1995) Medical Hypotheses
44: 149-154.
- Barber, M. D. and Fearon K. C. H. (2001) Lipids 36:
347-351.
- Mendez, B., P. R. Ling, et al. (1992) JPEN J Parenter Enteral
Nutr 16: 545-51.
- Conklin, K. A. (2002) Alternative Medicine Review
7:4-21.
- Wen, B., Deutsch E., et al. (2003) Brit J Cancer
89:1102-1107.
- Jordan, A., Stein J (2003) Eur J Nutr 42:324-331.
- Calviello, G., DiNicuolo F. et al. (2004) Cancer Chemother
Pharmacol (in press).
- Grammatikos, S. I., P. V. Subbaiah, et al. (1994). Cytotechnology 15(1-3): 31-50.
Práce byla podporována granty GAČR 524/04/0895 a IGA AV ČR 1QS50004050705
Datum přednesení příspěvku: 26. 5. 2005
