Využití RNA interference při regulaci genové exprese antionkogenu p53

Konference: 2005 XXIX. Brněnské onkologické dny a XIX. Konference pro sestry a laboranty

Kategorie: Nádorová biologie/imunologie/genetika a buněčná terapie

Téma: Pokroky v molekulární biologii nádorů

Číslo abstraktu: 057

Autoři: Mgr. Jana Kotašková; Mgr. Soňa Štruncová; R. Borská; MvDr. Boris Tichý, Ph.D.; B. Kusenda; Ing. Dana Dvořáková, CSc.; prof. MUDr. Jiří Mayer, CSc.; prof. RNDr. Šárka Pospíšilová, Ph.D.

Potenciálním nástrojem genové terapie se v posledních letech staly tzv. siRNA (small interfering RNA). SiRNA specificky interagují s cílovou mRNA, zprostředkovávají její degradaci a tím inhibují genovou expresi na posttranskripční úrovni. Vzhledem k tomu, že interakce siRNA s mRNA je vysoce sekvenčně specifická, je možné odlišit mutantní varianty genu a selektivně je utlumovat.
Nádorový supresor p53 hraje významnou úlohu v regulaci buněčného cyklu a po aktivaci buněčným stresem indukuje zastavení buněčného cyklu nebo apoptózu. Je funkční ve formě tetrameru, přičemž již jedna mutací pozměněná podjednotka může ovlivnit funkci celého proteinu. Mutace antionkogenu p53 se vyskytují u více než 50 % lidských nádorových buněk a některé z nich mohou vést k získání onkogenní funkce.
Prostřednictvím siRNA jsme sledovali úlohu wild-type a mutovaných forem p53 u buněčných linií Ewingova sarkomu. Pomocí transfekce vektoru nesoucího anti-p53 siRNA jsme inhibovali expresi antionkogenu p53 jak u buněk s wt, tak s mutovaným genem pro p53 a detekovali efekt tohoto zásahu na genovou expresi. Efektivitu utlumení exprese p53 jsme sledovali jak na úrovni RNA, tak na úrovni proteinů. Míra inaktivace RNA byla kvantitativně ověřována pomocí RQ RT-PCR. Po nukleofekci anti-p53 siRNA jsme dosáhli až 95 % efektivity utlumení exprese p53, a to u wild-type i u mutovaného p53. Podrobné změny expresních profilů byly vyhodnocovány pomocí DNA čipů. Změny na úrovni proteinů byly detekovány Western-blottingem. Na základě výsledků čipové analýzy byly vytipovány geny, jejichž změněná exprese souvisí se snížením exprese p53 a lze tedy předpokládat, že tyto geny jsou součástí p53-dependentních signálních drah, což je v současné době předmětem našeho dalšího výzkumu. Získané výsledky dokumentují, že kombinace přístupů využívajících RNA interferenci a DNA čipy je výhodným nástrojem pro analýzu funkce antionkogenu p53 a jeho mutantních variant.

Práce byla podporována granty MŠMT 1K04017, IGA MZ ČR NR8448-3/2005 a NF Elpida Nukleus.

Datum přednesení příspěvku: 26. 5. 2005