Zapojení PI3/Akt dráhy do apoptózy indukované TRAIL během neadherentní kultivace

Zachování rovnováhy mezi procesy proliferace, diferenciace a apoptózy buněk je typické pro zdravé epiteliální buňky tlustého střeva, tato rovnováha může být narušena během karcinogeneze. Epiteliální buňky tlustého střeva jsou uvolňovány do lumen na vrcholu krypty a umírají pomocí procesu, který se nazývá „detachment-induces apoptosis“ (anoikis). Anoikis zabraňuje odumřelým buňkám pronikat do okolních tkání a je tak významná pro udržení tkáňové organizace. Cytokinetické i adhezívní vlastnosti buněk tlustého střeva mohou být ovlivněny běžně přítomnými endogenními regulátory, jako jsou cytokiny. Sledovali jsme efekty „TNF-related apoptosis inducing ligand“ (TRAIL), který patří do TNF rodiny regulátorů buněčné smrti, na cytokinetické parametry a adhezívní vlastnosti buněčných linií odvozených od normální fetální tkáně (FHC buňky) a tkáně adenokarcinomu (HT-29 buňky) tlustého střeva ve spojení s navozením anoikis.

Pro navození podmínek vedoucích k indukci anoikis, jsme zavedli experimentální model neadherentní kultivace buněk. Buňkám je znemožněno přisednout ke kultivačnímu povrchu neustálým pohybem na 3D rotátoru. Výsledky cytokinetických experimentů ukazují větší citlivost buněk HT-29 k navození apoptózy působením TRAIL (DAPI analýza) než nenádorových FHC buněk během adherentní kultivace. Zajímavé bylo významné snížení apoptózy u buněk HT-29 během neadherentní kultivace ve srovnání s adherentní kultivací. Tento efekt by mohl být způsoben změnou v počtu receptorů pro TRAIL. Zjišťovali jsme proto, zda dochází ke změně v expresi těchto receptorů jak na povrchu buněk (FACS analýza) tak v celkových buněčných lyzátech (Western blot) během obou typů kultivací. Neprokázali jsme však žádné významné změny v expresi receptorů pro TRAIL.

Následně jsme zkoumali zapojení PI3/Akt dráhy, která podporuje přežívání buněk, do procesů vedoucích ke snížené citlivosti buněk k TRAIL během neadherentní kultivace. Výsledky ukazují zvýšenou fosforylaci Akt kinázy během neadherentní kultivace (Western blot). Abychom potvrdili zapojení dráhy PI3/Akt do tohoto procesu, detekovali jsme apoptotické proteiny (Western blot) po ovlivnění buněk TRAIL v kombinaci se specifickými inhibitory této dráhy. Po inhibici PI3/Akt dráhy jsme pozorovali posílení apoptózy oproti samotnému TRAIL u obou typů kultivací.

Cílem naší práce bylo srovnání efektů TRAIL na buňky tlustého střeva během adherentní a neadherentní kultivace. Výsledky ukazují sníženou schopnost buněk podléhat apoptóze po ovlivnění TRAIL během neadherentní kultivace ve srovnání s adherentní kultivací. Prokázali jsme, že tento efekt je spojený s aktivací PI3/Akt dráhy, která podporuje přežívání buněk.

Tato práce vznikla za podpory grantů GAČR 305/09/1526 a 524/07/1178 a AVČR 1QS500040507.