Analýza populačně specifických mutací genu BRCA1 – pilotní studie ve skupině neselektovaných pacientek s karcinomem prsu

Gen BRCA1 je tumor supresorový gen, spoluzodpovědný za udržování genomové stability. Zasahuje do regulace transkripce, a může se přímo podílet i na řízení buněčného cyklu a proliferace. Vstupuje do interakce s řadou komplexních proteinů účastnících se reparace poškozené DNA(MRE11/RAD50/Nbs1, SWI/SNF, BACH1). Defektní reparace DNA je považována za klíčový mechanismus, k nastartování procesu nádorové transformace buňky ^[6]. Příčinou predispozice k malignímu nádorovému onemocnění je přenos zárodečné mutace inaktivující jednu z alel (kopií) odpovědného genu. V cílové tkáni vede pak následná genetická změna (většinou ztráta druhé intaktní alely) k inaktivaci genu, která iniciuje tumorogenezi, např. v důsledku genomové nestability spojené se vznikem dalších mutací. Riziko onemocnění karcinomem prsu u nosiček mutace je celoživotně až 85%, karcinomem ovaria 40-60%. Průměrný věk při vzniku zhoubného nádoru je snížen proti sporadickým formám o 10-15 let ^[3].
Do dnešního dne bylo objeveno několik set různých alterací genomové sekvence genu BRCA1. Některé mutace se v určitých populacích vyskytují opakovaně a tvoří podstatnou část všech mutací zachycených v genu BRCA1 nebo BRCA2. Příkladem je populace středo a východoevropských Židů – Aškenaziů, kde je více než jedno procento žen nosičkami populačně specifických mutací 185del AG, 5382insC (v genu BRCA1) nebo 6174delT (v genu BRCA2) nebo populace islandská, v níž je nacházena mutace 999del5 v genu BRCA2 prakticky u všech pacientek s hereditárním karcinomem prsu. Podobně i v zemích střední a východní Evropy (Polsko, Maďarsko, Rusko, Pobaltí) je uváděn častý výskyt mutací 5382insC, C61G a 3819del5 v genu BRCA1 ^[5]. Obě centra, která se analýzou mutací genů BRCA1 a BRCA2 zabývají v České republice, udávají podobné výsledky^{[4, 2]}. Lze tedy říci, že tři mutace genu BRCA1 – C61G (300T>G), 3819del5 a 5382insC – jsou pro Českou republiku populačně specifické, tvoří téměř polovinu všech mutací zachycených v BRCA genech, ostatní mutace se vyskytují povětšinou solitárně.

Kompletní mutační analýza genů BRCA1 a BRCA2 je metodicky i finančně velmi náročná procedura a měla by být vyhrazena pouze indikovaným pacientkám ^[1]. Naproti tomu cílená detekce populačně specifických mutací je metodicky, časově i finančně nenáročná.

Cílem našeho projektu bylo vyvinout metodiky pro detekci populačně specifických mutací genu BRCA1 a ověřit jejich vhodnost pro populační screening u pacientek s karcinomem prsu.
Realizace v etapách:

• izolace a shromáždění genetického materiálu od skupiny neselektovaných pacientek s karcinomem prsu a od kontrolní skupiny zdravých pacientů
• vývoj metodik pro detekci jednotlivých populačně specifických mutací
• testování populačně specifických mutací ve skupině neselektovaných pacientek s karcinomem prsu a ve skupině zdravých kontrol

Detekční metoda, která by byla jednoduchá, rychlá a levná by byla, na rozdíl od komplexní mutační analýzy BRCA genů, při významném výskytu populačně specifických mutací vhodná jako screeningová metoda pro všechny pacientky s karcinomem prsu.

V rámci studie bylo s jejich informovaným souhlasem odebráno 7 ml periferní žilní krve 652 neselektovaným pacientkám s karcinomem prsu (Onkologická klinika 1. LF UK a VFN) a 812 zdravým kontrolám (pacienti dalších, především interních klinik, kteří netrpí žádným nádorovým onemocněním.
Z krevních vzorků byla na Ústavu biochemie a experimentální onkologie izolována genomická DNA a byl vytvořen archiv genetického materiál reprezentativní skupiny s karcinomem prsu a zdravých kontrol pro analýzu genetické dispozice ke vzniku karcinomu prsu.

Při volbě testovací metody jsme vycházeli z následujících požadavků:

• metoda musí být maximálně senzitivní (potlačit falešnou negativitu)
• musí být technicky snadná (manipulace s velkým množství vzorků) a rychlá
• musí být finančně nenáročná

Pro detekci mutace 3819del5 bylo využito spontánní tvorby eteroduplexů při amplifikaci s vyšším počtem cyklů a nízkou anelační teplotou. Heteroduplexy jsou dvouřetězce DNA tvořené vlákny pocházejícími ze dvou různých alel, která nasedají v místě mutace inkomplementárně. U vzorků s oběma zdravými alelami pozorujeme pouze homoduplexy (dvouřetězce, které jsou zcela komplementární – pocházejí z různých, avšak sekvenčně schodných alel bez mutace). Heteroduplexy a homoduplexy mají různou pohyblivost v agarózovém gelu.
Pro analýzu mutace c.5385dupC byla použita metoda tzv. PCR-mediated site directed mutagenesis (PSM), kdy se do blízkosti místa mutace zavádí prostřednictvím modifikovaného primeru inkomplementární nukleotid, který v kombinaci s (v našem případě) nemutovanou sekvencí vytváří restrikční místo, které je poté štěpeno enzymem Dde I. Produkty restrikce byly analyzovány na 2% agarózovém gelu.
Zvolené metody splňují požadavky vysoké senzitivity i specifity vyšetření pro dané sekvenční varianty i požadavky metodické a finanční nenáročnosti.
Standardně probíhala analýza v sériích po 96 amplifikátech, vždy se čtyřmi kontrolami (dvěma pozitivními, jednou negativní a jednou slepou) a 92 vzorky. Pozitivní vzorky byly sekvenovány a pozitivita konfirmována z dalšího nezávislého odběru krve.

Analýza populačně specifických mutací 5382insC a 3819del5 genu BRCA1 byla provedena u 592 neselektovaných pacientek s karcinomem prsu a 474 zdravých kontrol. Ve skupině žen s karcinomem prsu bylo identifikováno 7 mutací (1,18 %). Šest z nich tvořila mutace 5382insC a jednu mutace 3819del5. Ve skupině zdravých osob nebyla nalezena žádná mutace.
Na základě tohoto pozorování a při srovnání s daty publikovanými oběma českými skupinami ^{[2, 4]}, které se zabývají mutační analýzou genů BRCA1 a BRCA2, lze odhadovat, že frekvence mmutací genů BRCA1 a BRCA2 v populaci českých žen se pohybuje kolem hodnoty 1:500.
Věk v době diagnózy se pohyboval u pozitivních pacientek od 44 do 60 let věku, s průměrem 53,1 roku a mediánem 51 let. Pět ze sedmi pozitivních pacientek neuvádělo ve své rodinné anamnéze žádný výskyt nádorových onemocnění. Jedna pacientka referovala výskyt karcinomu vaječníků u sestry (věk v době diagnózy nezjištěn). U další jedné pacientky nebyla rodinná anamnéza zjištěna.
Podle kritérií pro indikaci ke genetickému vyšetření mutací genů BRCA1a BRCA2 vycházející z konsensu českých odborníků ^[1] by nebylo na základě dostupných informací k vyšetření indikováno minimálně 6 ze 7 pozitivních pacientek (85,7 %), neboť nevyhovují věkem ani rodinnou anamnézou indikačním kritériím.

Závěr: Analýza nejčastějších populačně specifických mutací odhalila ve skupině neselektovaných pacientek s karcinomem prsu sedm nosiček mutací (1,18 %). V kontrolní skupině zdravých osob nebyla detekována mutace žádná.
Pozitivní pacientky by při obvyklém postupu indikací ke genetickému vyšetření zřejmě z větší části zůstaly neodhaleny, neboť nesplňují obecně uznávaná indikační kritéria.
Použitá metodika je vysoce senzitivní a specifická. Je metodicky, časově i finančně nenáročná.
Dovoluje zachytit polovinu všech nosiček mutací genu BRCA1, u nichž se dispozice manifestuje vznikem karcinomu prsu, a to i těch, které by nebyly indikovány ke standardnímu genetickému vyšetření. Analýza populačně specifických mutací je přístupem, který zvyšuje záchytnost predispozičních mutací genů BRCA1 a BRCA2 v populaci, a tím umožňuje identifikaci i dalších dosud zdravých nosičů mutací (příbuzných pozitivních pacientek) a jejich zařazení do systému dispenzarizace a prevence.

Literatura

1. Bartoňková H, Foretová L, Helmichová E, Kalábová R, Kleibl Z, Konopásek B, Krutílková V, Macháčková E, Novotný J, Petráková K, Petruželka L, Plevová P, Pohlreich P, Rob L, Skovajsová M, Veselý J (2003) Doporučené zásady péče o nemocné s nádory prsu a vaječníků a zdravé osoby se zárodečnými mutacemi genů BRCA1 nebo BRCA2. Klin Onkol 16:28-34
2. Foretová L, Macháčková E, Navrátilová M, Pavlů H, Hrubá M, Lukešová M, Valík D (2004) BRCA1 and BRCA2 mutations in women with familial or early-onset breast/ovarian cancer in the Czech republic. Hum Mutat 23:397-398
3. Modugno F, Ovarian Cancer and High-Risk Women Symposium Presenters (2003) Ovarian cancer and high-risk women - implications for prevention, screening, and early detection. Gynecol Oncol 91:15-31
4. Pohlreich P, Stříbrná J, Kleibl Z, Zikán M, Kalbáčová R, Petruželka L, Konopásek B (2003) Mutations of the BRCA1 gene in hereditary breast and ovarian cancer in the Czech republic. Med Princ Pract 12:23-29
5. Szabo CL, King M-C (1997) Population genetics of BRCA1 and BRCA2. Am J Hum Genet 60:1013-1020
6. Welcsh PL, King M-C (2001) BRCA1 and BRCA2 and the genetics of brest and ovarian cancer. Hum Mol Genet 10:705-713